غیر فعال نمودن ژن ipab در شیگلا سونئی به منظور بررسی رفتار باکتری در مواجهه با رده سلولی اپیتلیال انسانی

عامل اصلی شیگلوزدر کشورهای صنعتی شیگلا سونئی بوده و مقاومت به آنتی بیوتیک های متعدد عامل گسترش باکتری است. در هر سال حدود 164 میلیون مورد آلودگی و 1/1 میلیون مورد مرگ در اثر این بیماری در سرتاسر جهان گزارش میشود. اخیرا در ایران تغییر الگوی گسترش از شیگلا فلکسنری به شیگلا سونئی گزارش شده است. در حال حاضر هیچگونه واکسن متداولی علیه شیگلا وجود ندارد. علت این امر بروز مشکلاتی در توسعه واکسن علیه این باکتری می باشد. فقدان مدل حیوانی مناسب، شواهد غیرمستقیم از مکانیسم های درگیر در ایمنی انسان و احتمالاً وفور بالای تبدیل فرم باکتری از جمله این مشکلات میباشند. شیگلا سونئی دارای دو فرم i وii میباشد که فرم i با از دست دادن پلاسمید بیماریزایی، به فرم iiتبدیل میشود. این وضعیت برای باکتری تخفیف حدت یافته نیز میتواند رخ دهد، بنابراین باکتری حاصل، توان ورود به سلول اپیتلیال را نخواهد داشت ودر نتیجه امکان القاء سیستم ایمنی را از طریق سلولهای دندریتیک از دست خواهد داد. مطالعات بیشتری جهت پایدار نمودن شیگلا در فرم i ضروری به نظر میرسد که در واقع اولین قدم در راستای دستیابی به یک واکسن کارآمد بر علیه شیگلا خواهد بود. شیگلا پس از اتصال از طریق طریق سیستم ترشحی نوع iii خود و با واسطه ipab به رشته های لکتین سطح سلولهای اپی تلیال روده عوامل بیماریزایی خود یعنی پروتئین های d، c،b ، a ipa را به داخل غشاء سیتوپلاسمی سلول میزبان وارد می نماید. این امر سبب ورود باکتری با مکانیسم ماکروپینو سیتوز به سلولهای m شده و با عبور ازاین سلولها به محل تجمع ماکروفاژها می رسد و وارد آنها می شود. با ادامه یافتن تولید پروتئین ipab روند آپاپتوز ماکروفاژ آغاز می گردد. در جهت دستیابی به یک باکتری تخفیف حدت یافته شیگلا سونئی بومی ایران که به غیر از ipab یعنی عامل مرگ ماکروفاژها، سایر آنتی ژنهای باکتری را در خود داشته و تحت شرایط کشت آنها را حفظ نماید در این پژوهش دو دسته فعالیت انجام شدند. 1-بهینه سازی شرایط محیط کشت شیگلا سونئی با هدف پایدار سازی این باکتری در فرم i. 2- غیر فعال سازی ژن کد کننده پروتئین ipab (ipab) که نقش محوری در رفتار تهاجمی باکتری دارد به منظور دستیابی به شکل پایدار کلنی شیگلا سونئی تاثیر دمای رشد و نوع محیط کشت بر شکل کلنی های باکتری جدا شده از بیمار بررسی شدند. همچنین ترکیباتی مانند ویتامینهای ب کمپلکس، ریبوفلاوین، نیکوتینیک اسید و کازامینواسید به محیط کشت پایه افزوده و تاثیر آنها بر شکل کلنی شیگلا سونئی ارزیابی شد. کشت شیگلا سونئی بر روی محیط دارای ریبوفلاوین و نیکوتینیک اسید رشد کلونی هایی صاف و گرد یعنی فرم i را در پی داشت و به عبارت دیگر باعث تثبیت کلنی ها در فرم i گردید . در مرحله دوم و به منظور تهیه باکتری فاقد ژن ipab استفاده از dna دو رشته ای خطی با 500 جفت باز همسان با بالادست و پایین دست این ژن در دو طرف ژن جایگزین شونده یعنی bla و انتقال آن به شیگلا سونئی مستعد دارای سیستم نوترکیبی ?-red باعث دستیابی به باکتری نوترکیب و جایگزینی ژن هدف با bla گردید. در مرحله بعد ژن ipab در پایین دست پروموتر آرابینوز کلون گردید و در پایین دست ipab ژن gfp کلون شده پلاسمید حاصل به شیگلا سونئی نوترکیب منتقل شد. در نهایت شیگلا سونئی نوترکیب فاقد ژن ipab، شیگلا سونئی نوترکیب دارای سازه کد کننده ipab و شیگلا سونئی وحشی(والد باکتریهای نوترکیب مذکور) هر سه از نظر توان ورود به سلول یوکاریوتی مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج نشان داد که شیگلا سونئی وحشی و باکتری نوترکیب دارای سازه کد کننده ipab و القاء شده با غلظت 1% آرابینوز می توانند وارد سلول های hela گردیده و در آنها تکثیر نمایند. این مشاهده در مورد شیگلا سونئی فاقد ژن ipab مطابق با انتظار و با عدم توانایی در آلوده سازی سلول اپیتلیال همراه بود. بدین ترتیب باکتری اخیر می تواند به عنوان سویه کاندید برای مطالعات تهیه واکسن زنده مورد استفاده قرار گیرد. کلید واژه: شیگلا سونئی، ipab، آپاپتوز، محیط کشت، نیکوتینیک اسید، سیستم نوترکیبی ?-red